Southern Blot

La hepatitis B es causada por la infección por el virus hepatitis B (VHB). Como componente esencial del ciclo de vida viral, el ADN circular cerrado covalentemente del VHB (ADNcc) se sintetiza y se mantiene en un bajo número de copias en el núcleo de los hepatocitos infectados, y sirve como plantilla de transcripción para todos los ARN virales. El procedimiento incluye dos pasos principales: 1. Extracción de ADNccNa de VHB mediante el método de extracción de ADN sin proteína Hirt; 2. Detección de ADNcc de VHB mediante análisis de transferencai Southern.

El método es sencillo y confiable para el ensayo de ADNccNa con muestras de cultivos celulares, y el útil tanto para la biología molecular del VHB como para la investigación antiviral.

Referencias Bibliográficas:

1. Cai D, Nie H, Yan R, Guo JT, Block TM, Guo H. A southern blot assay for detection of hepatitis b virus covalently closed circular DNA from cell cultures [Internet]. Vol. 1030, Methods in Molecular Biology. 2013 [citado el 20 de noviembre de 2019]. p. 151–61. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5060941/

Prueba de PCR en Hepatitis B

Tema: PCR cuantitativa en tiempo real para el diagnóstico del virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C.

Objetivo: Desarrollar un método sensible para cuantificar ADN de VHB y ARN de VHC en sueros de pacientes infectados mediante PCR cuantitativa en tiempo real para poder diagnosticar y dar un efectivo tratamiento para la Hepatitis viral.
Muestra biológica: Suero

Tipo de Ácido nucleico: ADN de VHB y ARN de VHC.

Gen a amplificar: Para el VHB se usó el gen S (116 bp) y para el VHC se se amplificó la región no codificante (238 bp)
Extracción del ADN: Se extrajo 200 μL de suero usando un kit QIAamp MinElute Virus Spin

Tipo de PCR: PCR en tiempo real (qPCR)
                         rt-PCR: 35 ciclos: Desnaturalización: 95ºC por 1minuto.
                                                       Anillamiento: 60ºC por 1 minuto.
                                                       Extención: 72 ºC por 2 minutos.
                         qPCR: 45 ciclos:   Desnaturalización: 95ºC por 15 segundos.
                                                       Anillamiento: 60ºC por 1 minuto.
                                                       Extención: 72 ºC por 2 minutos.
Visualización: Todos los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% y tinción de geles con nitrato de plata.

Especificidad analítica: Los cálculos demostraron que el método es 100% efectivo en identificar el VHB en los individuos infectados. (No especifica información)
Sensibilidad analítica: La eficiencia del método para detectar VHB es del 38,72 %.  (No especifica información)

Referencias Bibliográficas:

1. Zauli DAG, Menezes CLP de, Oliveira CL de, Mateo ECC, Ferreira AC de S. In-house quantitative real-time PCR for the diagnosis of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections [Internet]. Vol. 47, Brazilian Journal of Microbiology. Elsevier Editora Ltda; 2018 [citado el 13 de noviembre de 2019]. p. 987–92. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5052370/

Prueba de Tamizaje y Confirmatoria

Prueba de Tamizaje._ La prueba anti-core-total (Anti-HBcII) permite detectar la Hepatitis B, basado en un estudio de sangre donde tiene como objetivo la detección del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HbsAg), donde para lograr esto se utiliza un anticuerpo (anti-HbsAg) en fase sólida, que se une al antígeno presente en el suero del paciente, el cual reacciona frente a un conjugado marcado con una coenzima, la que en contacto con un sustrato apropiado desarrolla una reacción colorimétrica la que puede ser leída visual o instrumentalmente.

Prueba Confirmatoria.- Las pruebas serológicas se realizan mediante pruebas de diagnóstico rápido (TDR) o inmunoensayos enzimáticos de laboratorio (EIA) para la detección del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). La prueba de confirmación ELISA para muestras positivas de HBsAg sospechosas es un método de validación inicial simple, preciso y de bajo costo.

Referencias Bibliográficas:
1. Bottero J, Boyd A, Gozlan J, Carrat F, Lemoine M, Rougier H et al. Effectiveness of hepatitis B rapid tests toward linkage-to-care: results of a randomized, multicenter study. - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2016 [cited 7 Noviembre 2019]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26954517
2. Parry J, Sands A, Easterbrook P. One or two serological assay testing strategy for diagnosis of HBV and HCV infection? The use of predictive modelling [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2017 [cited 7 Noviembre 2019]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5688456/

Alteraciones en la Epigenómica

La metilación es un mecanismo de regulación de la expresión de genes, que consiste en la adición de grupos metilo a las citosinas de ciertas secuencias de ADN; esta modificación química puede producir el silenciamiento de un gen. Teniendo en cuenta que el genoma del VHB puede resistir en el núcleo de los hepatocitos en forma de minicrosoma, es posible que la metilación del ADN del VHB represente un mecanismo que puede modificar la replicación y la expresión de proteínas virales. Una evidencia de este mecanismo, es que la metilación de la secuencia que codifica para la proteína Core produce pérdida de expresión de la proteína; esto ha sido demostrado in vitro en una línea celular de hepatoma humano (PLC/PRF/5). Es importante mencionar que elementos reguladores del genoma del VHB se encuentran localizados en secuencias de ADN ricas en pares de citosinas y guanina.

Representación esquemática de los cambios de cromatina en el ADNcc en relación con la replicación viral.
Tomado de: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2015.01491/full

Referencias Bibliográficas:
1. Zeybel M, Vatansever S, Hardy T, et al. DNA methylation profiling identifies novel markers of progression in hepatitis B-related chronic liver disease. [internet] Clin Epigenetics. 2016; 8:48. [citado 30 Noviembre de 2019] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4857425/

Alteración en la Traducción G1862T del HBV

Una sustitución de valina por fenialanina en la posición -3 de la escición del péptido da como resultado un cambio estructural del antígeno central de la hepatitis (HBcAg) y otros componentes del HBV como HBeAg, preC. Se ha demostrado que cuando existe una función normal de HBcAg se induce a activar vías que detonan en un posible hepatocarcinoma. Por lo tanto, pacientes que tienen el HBV con la mutación G1862T llevan una menor tendencia a la enfermedad hepática grave.

Referencias Bibliográficas:

1. Bhoola N, Kramvis A. Expression of wild-type or G1862T mutant HBe antigen of subgenotype A1 of hepatitis B virus and the unfolded protein response in Huh7 cells. Journal of General Virology [Internet]. 2017 [citado 24 octubre 2019]98(6):1422-1433. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28678685

Alteraciones en la Transcripción

La polimerasa del VHB presenta actividad de transcripción reversa, de ADN polimerasa y de ARNasa H; sin embargo, no posee actividad exonucleasa 3'-5' y por lo tanto no corrige los errores en la secuencia generados durante el proceso de retro-transcripción y de síntesis de la cadena positiva del genoma viral. La tasa de mutaciones del VHB es de 2,3 x 10^-5 sitios/año. Mutaciones en la secuencia que codifica el determinante "a" del HBsAg se denominan variantes de escape; estas mutaciones son importantes epidemiológicamente porque a pesar de que su prevalencia es baja, pueden ser seleccionadas y diseminarse causando así infección en individuos vacunados.

Mutaciones más frecuentes en la principal región hidrofílica del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. En cuadro negro se muestran las variantes de escape en el determinante "a" asociadas a vacunación; en cuadro azul las variantes de escape fuera del determinante "a" y en cuadro naranja las mutaciones asociadas a resistencia antiviral en la región del ORF S que sobrelapa con el dominio catalítico de la polimerasa.

Referencias Bibliográficas:

1. Jaramillo C, Navas M. Variantes de escape del virus de la hepatitis B. Rev. chil. infectol.  [Internet]. 2015  Abr [citado  12 de octubre 2019] ;  32( 2 ): 190-197. Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182015000300008

2. Serra M. Virus de la Hepatitis B [Internet].2014 [citado 12 de Octubre 2019]. Disponible en: http://www.aefa.es/wp-content/uploads/2014/04/Virus-de-la-Hepatitis-B-.pdf
3.  Ryan K, Ray C. Sherris. Microbiología médica (6a. ed.). 6th ed. Distrito Federal: McGraw-Hill Interamericana; 2017.

Alteraciones en la Genómica

Es imprescindible la diferenciación de 4 genes: gen P (codifica ADN polimerasa viral), gen C (para HBcAg y HBeAg), gen S (para HBsAg) y gen X (para proteína no estructural: HBxAg). La región S es la región más conservada del ORF S del VHB; las mutaciones en esta tienen mucha relevancia en la antigenicidad de la proteína: una mutación se da en el nucléotido 587, donde la sustitución de adenosina por guanosina se traduce en cambios de los aminoácidos de la proteína de superficie (HBsAg), lo que origina una alteración en los epítopos inmunodominantes que impide su reconocimiento con anticuerpos monoclonales específicos.

Mutaciones más importantes reportadas en el ORF S (región S)del genoma del virus de hepatitis B

Referencias Bibliográficas:

1. Jaramillo C, Navas M. Variantes de escape del virus de la hepatitis B. Rev. chil. infectol.  [Internet]. 2015  Abr [citado  10 de octubre 2019] ;  32( 2 ): 190-197. Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182015000300008

2. Alonso R, Aguilera A, Córdoba J, Fuertes A. Diagnóstico microbiológico de las hepatitis virales. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2015; 33(9): p. e53-e62. Disponible en: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-cl inica-28-articulo-diagnosticomicrobiologico-las-hepatitis-virales-S0213005 X14003012
3. Macas Silva D. Diagnóstico serológico de la hepatitis b [Internet]. Repositorio Digital de la UTMACH. 2019 [citado 10 de octubre 2019]. Disponible en: http://186.3.32.121/handle/48000/13887